Біологічні властивості дисоціативних L- та інших форм Mycobacterium bovis

Abstract

Селекційовано расу змінених форм мікобактерій з особливими властивостями, що можуть виявитися перспективними для конструювання протитуберкульозної вакцини. Встановлено, що персистенція досліджуваних мікроорганізмів (27-ма субкультура некислотостійких паличок і L-форм) в організмі морських свинок триває дев’ять (період досліду) і більше місяців. Проте із суспензії, приготовленої із макроскопічно незмінених органів дослідних тварин, виділено кислотостійкі елементарні тільця (зерна) та типові морфологічні форми палички, які на щільному живильному середовищі утворили на третю добу помаранчеву культуру. Інокуляція виділених кислотостійких мікобактерій (культура-ревертант) морським свинкам (1 мг/см3) не супроводжувалася розвитком алергічного стану (алергічна реакція на ППД-туберкулін (протеїн пурифайд дериват – сухий очищений білок) для ссавців та ААМ (алерген з атипових мікобактерій) через 30, 60 і 90 діб негативна), проте з органів евтанізованих через три місяці дослідних тварин виділено кислотостійкі мікобактерії, які на третю добу утворювали культуру помаранчевого кольору. Багаторазові пасажі через штучне живильне середовище (щільне), тривале перебування (20 місяців) за низької плюсової температури змінили генетичний баланс, що забезпечило виживання бактерій внаслідок втрати одних (характерних для патогенного мікроорганізму) та набуття інших (зокрема атипових) властивостей, частково притаманних іншим мікобактеріям. У той же час персистенція в організмі морських свинок типових морфологічних кислотостійких форм (палички), які реверсували з L-форм, не супроводжується розвитком захворювання. Вони зберігають здатність утворювати пігменти та утворюють колонії (культура-ревертант) на щільному живильному середовищі починаючи з першої генерації (з біологічного матеріалу морських свинок) на другу добу культивування. Втрата сенсибілізувальної здатності у мікобактерій, багаторазово пасажованих і персистуючих в організмі морських свинок, може свідчити (звичайно, тільки певною мірою) про втрату імуногенної здатності, оскільки відомо, що розвиток алергічної (туберкулінової) реакції та її інтенсивність свідчать про імунологічну перебудову макроорганізму (розвиток інфекційного процесу) з набуттям специфічної стійкості. Виявлено залишкову вірулентність досліджуваних змінених форм Mycobacterium bovis із можливим формуванням специфічного протитуберкульозного імунітету без розвитку необхідного рівня, який виявлявся діагностикумом алергічного стану, та утворення виразки на ділянці уведення зависі мікобактерій. Бактеріоскопія мазків-відбитків з органів евтаназованих (через 80 діб) тварин виявила некислотостійкі палички, зерна-тільця. У контролі маса тіла тварин тенденційно збільшується, а бактеріоскопічні дослідження (мазки-відбитки) виявляються негативними. Мікобактерії з новими, генетично закріпленими властивостями володіють здатністю стимулювати доброякісний інфекційний процес без розвитку алергії. Можливо, згасання активності генів, відповідальних за патогенні властивості, які визначаються окисно-відновними процесами (дегідрогеназна, каталазна активність тощо) та генами, які перебували в неактивному стані, інтенсифікують метаболічні процеси синтезу пігменту з пригніченням дії факторів (токсинів) патогенності. Не встановлено залежності між швидкістю розмноження (строки утворення колоній) та патогенністю, оскільки вихідна материнська культура (третя генерація) досліджуваних змінених форм M. bovis володіла високою вірулентністю та формувала колонії на другу-третю добу, не утворюючи пігменту та не володіючи вираженою дегідрогеназною та каталазною активністю. У статті розглянуто штами M. bovis, відмінні за біологічними властивостями від патогенних штамів. A race of modified forms of mycobacteria with special properties that can be promising for the construction of TB vaccines was selected. It was found that the persistence of the researched microorganisms (27th subculture of acid-fast bacillus and the L-form) persisted for nine months (the period of research) and longer in the bodies of guinea pigs. However, from the suspension prepared from macroscopically unchanged organs of the experimental animals we found acid-proof elementary bodies (grains) and bacilli of typical morphological forms, which formed an orange culture on the nutrient medium on the third day after suspension seeding. The inoculation of guinea pigs with isolated acid-proof mycobacteria (culture-revertant) (1 mg/cm3) was not accompanied by the development of allergic condition (allergic reaction to the tuberculin and AAM was negative at 30, 60 and 90 days); however, acid-proof bacilli, which formed an orange culture, were isolated on the the third day from experimental animals which had been subjected to euthanasia. Multiple passages through the artificial culture medium (dense), prolonged exposure (20 months) at low plus temperature changed the genetic balance, ensuring their survival as a result of the loss of some (specific to the pathogen) and the acquisition of new properties (especially atypical ) which are partly inherent in other mycobacteria. At the same time, the persistence in the body of guinea pigs of typical morphological acid-proof forms (bacilli) that reverse from L-forms was not accompanied by the development of the disease. They are chromogenic and retain the ability to form colonies (culture-revertant) on dense nutrient medium from the first generation (from biological material of the guinea pigs) on the second day of cultivation. The loss of sensitization ability of Mycobacterium bovis which were passed many times and persistent in the body of guinea pigs can probably testify to the loss of immunogenic capacity, since the development of allergic (tuberculin) reaction, as well as its intensity, indicates an immunological restructuring of the microorganism (the development of an infection) with the parallel acquisition of the specific resistance. We observed a residual virulence of the researched modified forms of M. bovis with the possible formation of specific antiTB immunity without development of the necessary level, which was the indicator of allergic condition and ulceration of the site where the suspension of mycobacteria was introduced. Microscopy of smears of organs of the euthanized animals (after 80 days) revealled acidnonproof bacilli, seeding cells. In the control, the weight of the animals tended to increase while the bacterioscopic research (smears) proved negative. Mycobacteria with new, genetically fixed properties have the ability to stimulate benign infectious process, without the development of allergies to the level required for the detection by PPD- for mammals AAM. However, it should be noted that perhaps the extinction of the activity of genes responsible for the pathogenic properties, which are determined by redox processes (dehydrogenase, catalase activity, etc.) and genes which were in a dormant state, activate metabolic processes of pigment synthesis with inhibition of the action of pathogenic factors (toxins). We did not find a relationship between the rate of reproduction (duration of colony formation) and pathogenicity because the original parent culture (third generation) of the investigated modified forms of M. bovis had a high virulence and formed colonies on the second or third day without forming pigment and did not express dehydrogenase and catalase activity. In this article we discuss strains of M. bovis which differ in biological properties from pathogenic strains.