Фільтривні форми дисоціантів Mycobacterium bovis: ідентифікація та їх біологічні властивості

Abstract

Дисертаційна робота присвячена вивченню біологічних властивостей (культуральні, тинкторіальні властивості, морфологія, ферментативна активність, вірулентність) дисоціативних форм Mycobacterium bovis і їх фільтривних форм та визначенню ефективної методики ідентифікації фільтривних форм. Проблема туберкульозу актуальна як для ветеринарної, так і для гуманної медицини. Складності у вирішенні цієї проблеми обумовлені надзвичайною гнучкістю метаболічних процесів в мікобактеріальних клітинах, їх здатністю змінювати морфологію та ферментативну активність у відповідь на дію зовнішніх факторів – це значно ускладнює діагностику цього захворювання та можливість викорінення збудника. В дослідженні використано 15 культур M. bovis, які зберігали на живильному середовищі протягом 9–12 років в умовах низьких плюсових температур (3,0±0,5°С). Використані культури протягом тривалого часу піддавались впливу декількох несприятливих чинників: низька температура, нестача поживних речовин і зниження вмісту кисню через використання мікобактеріями в процесі життєдіяльності. Установлено, що багаторічно збережені мікобактерії, проявляють свою життєздатність і за пересіву на свіже живильне середовище здатні утворювати субкультури. З’ясовано, що така здатність на 28,0 % вища в культур, які зберігалися на середовищі з рН 6,5. Виявлено здатність мікобактерій субкультур швидкорослого штаму M. bovis зростати за температури 3,0±0,5 °С, чого раніше не спостерігали. Встановили, що за висіву на свіже живильне середовище лише 66,7% із багаторічно збережених культур виявились здатними утворювати нові субкультури. В інших 33,3 % росту не виявили за жодного температурного режиму, що може свідчити про втрату здібності розмножуватись після тривалого зберігання. Порівнявши морфологію мікобактерій до зберігання та за проходження 9-12 років відмітили поліморфізм (паличкоподібні, довгі ниткоподібні варіанти, зерна, та L-форми). Довготривале зберігання призвело до формування зерен та L-форм та втрати кислотостійкості більшістю бактеріальних клітин. Дослідивши мікобактерії культур методом скануючої електронної мікроскопії відмітили незвичну рельєфність поверхні клітини, за багаторічного зберігання культур, в той час, як в клітин молодих культур поверхня була гладенькою. Культуральні властивості отриманих субкультур відрізнялись від вихідних культур. Деякі субкультури виявились пігментоутворюючими. Більшість субкультур за температури культивуваня 37,0±0,5оС мали жовтий та помаранчевий, а за 3,0±0,5 оС – синьо-зелений пігменти. Поверхня в більшості культур була гладка (S). У культурах багаторічно збережених та субкультурах, отриманих з них, реєструвався поліморфізм мікобактерій. Під час мікроскопії виявляли палички різної довжини та товщини із заокругленими кінцями, довгі ниткоподібні форми, зерна (елементарні тільця), округлі та овальні L-форми різної величини. Мікобактерії субкультур в переважній більшості не були кислотостійкими. Біологічною пробою на морських свинках встановлено втрату вірулентності дослідними культурами. Під час біопроби в заражених тварин не спостерігали зниження маси тіла, утворення виразок в місці введення завису мікобактерій та збільшення пахвинних лімфатичних вузлів, алергічна реакція на введення ППД-туберкуліну була відсутня. По закінченню терміну досліду (90 діб) констатували відсутність патологоанатомічних змін в органах. Після першої біологічної проби з органів лабораторних тварин вдалось виділити культури в 100,0 % випадків, після другої біопроби – 50,0 %, а після третьої – жодної культури не було виділено. Доведено існування в популяції мікобактерій фільтривних форм, здатних проходити через бактеріальні фільтри з розміром пор 0,05 та 0,1 мкм. Такі форми за висіву на живильне середовище здатні реверсувати в паличко-, овало- та кокоподібні морфологічні форми, зерна та рости утворюючи нові культури. Дослідженням встановлено, що низька температура культивування – 3,0±0,5 оС сприяє кращому виділенню культур мікобактерій з фільтратів, отриманих за проходження через фільтри з порами обох розмірів (0,05 і 0,1 мкм). Генерування в фільтривних форм в культурах мікобактерій не є постійною ознакою та коливається в залежності від зміни середовища існування. Найвища здатність до генерування фільтривних форм спостерігалась в культурах, які отримали після одноразового пасажування культур адаптованих до існування in vitro через організм морських свинок (виділяли 100,0 % культур). В культурах отриманих після дворазового пасажування через організм лабораторних тварин фільтривних форм виділялось менше – 75,0 %, а в культур багаторічно збережених invitroта молодих субкультур лише 50,0 %. Культури, отримані з фільтратів мали культуральні властивості, відмінні від вихідних (зміна форми, розміру колоній і пігменту) і меншу інтенсивність росту. Мікроскопічним дослідженням культур виявлено елементарні тільця та L-форми. Культура отримана із завису фільтрованого через бактеріальний фільтр з розміром пор – 0,05 мкм, повністю змінила свою морфологію та була утворена клітинами з дефіцитною клітинною стінкою. За тинкторіальними властивостями мікобактеріальні клітини, які утворювали ці культури, не володіли кислотостійкістю. Розміри бактеріальних клітин в культурах, отриманих після проходження через бактеріальні фільтри, були більші, ніж в контрольних (нефільтрованих). Чим меншим був діаметр пор фільтра, тим більшими виявлялись клітини мікобактерій в культурах отриманих з фільтратів. Дослідженням за допомогою методу скануючої електронної мікроскопії встановлено, що мікобактерії досліджених культур здатні розмножуватись трьома різними способами: бінарний поділ, асиметричне ділення та брунькування. При розмноженні паличкоподібних та овалоподібних форм бінарним поділом реєструвалось характерне V-подібне розташування клітин. За розмноження асиметричним способом ділення з довгої ниткоподібної форми утворювались дві та більше паличкоподібних. Розмноження брунькуванням було характерне для гігантських L-форм мікобактерій. За цього типу розмноження спостерігалось утворення на одному з кінців бактеріальної клітини брунькоподібного відростку, який поступово збільшувався в розмірах і перетворювався на нову бактеріальну клітину з дефіцитною клітинною стінкою, подібну до материнської. Після остаточного формування дочірньої клітини та набуття її розмірів наближених до материнської відбувалось їх роз’єднання. Мікобактерії здатні змінювати біохімічну активність під впливом зовнішніх факторів. У дисоціативних форм (117-а, 117-б, 117-в, 118) зі збільшенням кількості пересівів субкультур підвищується активність нітратредуктази та знижується активність пероксидази, дегідрогенази та каталази (порівнювали 15 і 240 генерації). Низька плюсова температура культивування (3,0±0,5 ºС) сприяє підвищенню каталазної активності та здатності до гідролізу ТВІН-80. Після одноразового пасажування через організм морських свинок, M. bovis підвищує активність дегідрогенази та каталази, знижує нітратредуктазну активність і здатність до гідролізу ТВІН-80. Після другого пасажу через організм морських свинок в отриманих культур знизилась дегідрогеназна активність, підвищились здатність до редукції нітратів і до гідролізу ТВІН-80 порівняно з культурами, отриманими після першого пасажу через організм лабораторних тварин. В культурах, отриманих з фільтратів, ферментативна активність дегідрогенази, нітритредуктази та здатністю до гідролізу ТВІН-80була нижчою, проте каталазна активність була виражена в мікобактерій майже всіх культур. Пероксидазна активність була відсутня в усіх культурах окрім контрольного вірулентного штаму. Результати дисертаційної роботи можна використовувати в науково-дослідницькій роботі кафедр і в освітньому процесі для підготовки фахівців зі спеціальності 211 «Ветеринарна медицина», а також при виділенні фільтривних форм бактерій в науково-дослідних установах і плануванні заходів діагностики, боротьби та профілактики туберкульозу в господарствах. The aim of the thesis is to study biological properties (cultural, tinctorial properties, morphology, enzymatic activity, virulence) of dissociative forms of Mycobacterium bovis and their filrable forms and to develop effective methods of these formsidentification. The problem of tuberculosis is relevant for both veterinary and humane medicine. It cannot be solved easily because of extreme flexibility of metabolic processes in mycobacterial cells, their ability to change morphology and enzymatic activity in response to external factors, so the diagnosis of this disease and the possibility of the pathogeneradication are very complicated. The study used 15 cultures of M. bovis, which were stored on nutrient medium for 9–12 years at low above-zerotemperatures (3,0±0,5 °С). For a long time used cultures have been exposed by several adverse factors: low temperature, lack of nutrients and reduced oxygen content due to the use of mycobacteria in the life process. The research confirmed that mycobacteria, which have been stored for many years, show their viability and are able to form subcultures when transplanted to fresh nutrient medium. This ability is by 28.0% higher in cultures stored in a medium with a pH of 6.5. The study showed that fast-growing strain of subcultures mycobacteria of M. boviscan grow at a temperature of 3,0±0,5 °C, which was not observed before.Only 66.7% of long-term stored cultures were able to form new subculturesafter placing on fresh nutrient medium. The other 33.3% did not grow at any temperature, which may indicate a loss of reproductivity after prolonged storage. Comparing the morphology of mycobacteria before storage and after 9-12 years storage period, we noted polymorphism (rod-shaped, long filamentous variants, granules, and L-forms). Long-term storage has led to the formation of granules and L-forms and loss of acid resistance by most bacterial cells. Examining the cultures mycobacteria by scanning electron microscopy we noted that the long-term storage cultures have unusual cell relief, while the surface of young cultures cells was smooth. The cultural properties of the obtained subcultures differed from the original ones. Some subcultures turned out to be pigment-forming. Most subcultures had yellow and orange pigments at cultivation temperatures of 37,0±0,5°C, and blue-green pigments at 3,0±0,5 °C. The surface of the most cultures was smooth (S). Mycobacterial polymorphism was registered in long-term storage cultures and subcultures obtained from them. Microscopy revealed rods of different lengths and thicknesses with rounded ends, long filamentous shapes, granules (elementary bodies), rounded and oval L-shapes of different sizes. Most of subcultures mycobacteria were not acid-resistant. The guinea pigsbioassay revealed loss of virulence by experimental cultures. During the bioassay there was no decrease in animals body weight, ulceration at the site of injection of mycobacterial suspension and enlargement of inguinal lymph nodes. Allergic reaction to the introduction of PPD-tuberculin was absent. At the end of the experiment (90 days) we stated the absence of pathological changes in the organs. After the first biological sample from the organs of laboratory animals we managed to isolate cultures in 100.0% of cases, after the second - 50.0%, and after the third –noculture was isolated. The experiment provedthe existence of filtrate forms capable to pass through bacterial filters with a pore size of 0.05 and 0.1 μm. After an inoculation on a nutrient medium such forms are able to reverse into rod-, oval- and coccoid morphological forms, granules and grow to form new cultures. The study found that the low culture temperature - 3,0±0,5 °C promotes better isolation of mycobacteria cultures from the filtrates obtained by passing through filters with pores of both sizes (0.05 and 0.1 μm). Creation of filterableforms in mycobacteria cultures is not a constant feature and varies depending on habitat changes. The highest ability to generate filter forms was observed in cultures obtained after a single passage of cultures adapted to the existence in vitro through the body of guinea pigs (isolated 100.0% of cultures). In cultures, obtained after two passages through the body of laboratory animals, it was released lessfiltrate forms - 75.0%, and in cultures of long-term storage in vitro and young subcultures only 50.0%. Cultures,which obtained from the filtrates, differed from the original ones (change in shape, size of colonies and pigment) and had lower growth intensity. Microscopic examination of cultures detected elementary bodies and L-forms. The culture, obtained from inoculation, which was filtered through a bacterial filter with a pore size of 0.05 μm, completely changed its morphology and was formed by cells with a deficient cell wall. According to tinctorial properties, the mycobacterial cells that formed these cultures did not have acid resistance. The size of bacterial cells in cultures obtained after passing through bacterial filters were larger than in control (unfiltered). The smaller the pore diameter of the filter was, the larger the mycobacterial cells in the cultures obtained from the filtrates were. Scanning electron microscopy has shown that the mycobacteria of the studied cultures are able to reproduce in three different ways: binary division, asymmetric division and budding. During the reproductionof rod-shaped and oval-shaped formsby binary division, the V-shaped arrangement of cells was registered. During reproductionby asymmetric method of division, two or more rod-shaped ones were formed from a long filamentous one. Reproduction by budding was characteristic of giant L-forms of mycobacteria. In this type of reproduction, the formation of a bud-like process at one end of the bacterial cell was observed, which gradually increased in size and turned into a new bacterial cell with a deficient cell wall similar to the mother’s one. After the final formation of the daughter cell and after its size was close to the mother’s, their separation took place. Mycobacteria are able to change biochemical activity under the influence of external factors. In dissociative forms (117-a, 117-б, 117-в, 118) with increasing number of subcultureinoculation, the activity of nitrate reductase increases and the activity of peroxidase, dehydrogenase and catalase decreases (compared 15 and 240 generations). The low above-zero cultivation temperature (3,0±0,5 ºС) increases the catalase activity and the ability to hydrolyze TWIN-80. After a single passage through the body of guinea pigs, M. bovis increases the activity of dehydrogenase and catalase, reduces nitrate reductase activity and the ability to hydrolyze Tween-80. After the second passage through the body of guinea pigs dehydrogenase activity in the obtained cultures decreased, the ability to reduce nitrates and hydrolysis of Tween-80 increased compared with cultures obtained after the first passage. In the cultures obtained from the filtrates, the enzymatic activity of dehydrogenase, nitrite reductase and the ability to hydrolyze TWIN-80 was lower, but the catalase activity was expressed in mycobacteria of almost all cultures. Peroxidase activity was absent in all cultures except the control virulent strain. The results of the dissertation can be used in research work of departments and in the educational process for teaching applicants in the specialty 211 "Veterinary Medicine", as well as in the selection of filtrate forms of bacteria in research institutions and in planning measures for diagnosis, control and prevention of tuberculosis on farms.