Жуки-шкідники зернових запасів: резервуар та чинник передачі мікобактерій туберкульозу

Abstract

Наукова робота присвячена встановленню епізоотологічної ролі рисового довгоносика (Sitophilus oryzae (Linnaeus, 1763), Coleoptera, Curculionidae) як потенційного резервуару M. bovis у процесі виникнення та поширення туберкульозу. Вивчено тривалість накопичення всередині організму комахи та виділення дисоціативної та патогенної форм мікобактерій туберкульозу в зовнішнє середовище довгоносиком. Визначено вплив пасажування через органнім жука на морфологію та біологічні властивості (культуральні, тинкторіальні, біохімічні, вірулентні) збудника. Питання туберкульозу є актуальним протягом багатьох років через активне поширення збудника інфекції по всьому світу, зокрема й в Україні. Нині це питання загострилось в Україні в зв’язку з бойовими діями, які спричинюють посилену міграцію тварин, як природню, так і штучну (евакуація), що становить потенційну загрозу, погіршує епізоотичну ситуацію та активує поширення зоонозів, зокрема туберкульозної інфекції. У даній роботі дослідження проводили із використанням дисоціативних (117-а та 118 пасажі) і вірулентного (пасаж №100) штамів M. bovis, які зберігались у музеї кафедри інфекційних хвороб ДДАЕУ та отриманих із них субкультур. При отриманні субкультури визначали оптимальну температуру культивування збудника. Встановили, що досліджувані штами мають стійкі властивості, які зберігаються при пересіві на свіже живильне середовище. Відмічали пришвидшення появи первинного росту субкультур 100-го пасажу в 2,1 рази, 117-а пасажу в 1,1-1,3 рази, зниження прояву росту субкультури 118-го пасажу в 2,0-2,3 рази порівняно з вихідними культурами. В отриманих субкультурах визначили життєздатність мікобактерій шляхом підрахунку колонієутворюючих одиниць і з’ясували, що вони придатні для проведення наступних етапів експерименту. Визначили, що для інфікування жуків необхідною концентрацію мікобактеріального завису є 1 мг в 1 см3 0,9 % ізотонічного розчину натрію хлориду на кожні 10 г зерна пшениці, це забезпечує інфікування 100 % жуків, що утримуються на контамінованому субстраті. Встановили здатність рисового довгоносика до механічного перенесення життєздатних мікобактерій на поверхні тіла. Дослідивши період носійства жуками збудника туберкульозу довели здатність до тривалого резервування мікобактерій у організмі комахи. Зокрема, у І серії експерименту при роботі з дисоціативним штамом протягом 50-ти діб виявляли збудник у гомогенізаті жуків та в змивах із поверхні тіла довгоносика з поступовим зниженням кількості мікробних клітин у полі зорі мікроскопа. При посіві гомогенізату інфікованих жуків на живильне середовище, прояв росту дослідних мікобактерій спостерігали лише до 30-ї доби після початку експерименту, що свідчить про втрату життєздатності мікобактерій після більш тривалого перебування в організмі жука. У ІІ серії досліду при інфікуванні рисового довгоносика вірулентним штамом мікобактерій, у мазках і гомогенізаті з жуків виявляли збудник до 30-ї доби включно, а під час мікроскопії змивів із поверхні тіла – до 20-ї доби. Аналогічно до першої серії експерименту при посіві гомогенізату на живильне середовище – прояв росту спостерігали лише в пробірках, що були засіяні на 30-ту добу експерименту. Дослідивши тривалість виділення мікобактерій та контамінацію об’єктів зовнішнього середовища рисовими довгоносиками з’ясували, що при інфікуванні дисоціативними формами M. bovis під час мікроскопічного дослідження суспензії з зерна виявляли до 12-ї доби досліду (до третьоі пересадки жуків), а на живильному середовищі ріст реєстрували протягом 30-ти діб після початку експерименту (тобто до п’ятої пересадки жуків). В експерименті з патогенним штамом у гомогенізаті з жуків мікобактерії виявлені аналогічно до 12-ї доби, а прояв росту на середовищі – до 20-ї доби після інфікування. За морфологією та культуральними властивостями виділений упродовж двох серій експерименту збудник був ідентичним до вихідної культури. На кожному етапі експерименту виділені культури проходили молекулярно-генетичну ідентифікацію з підтвердженням видової належності. Генотипізацію культур проведено з використанням VNTR-методу. Доведено, що довжина фрагментів ампліконів отриманих в результаті ПЛР із праймерами, що направлені на цільові VNTR-локусу є ідентичною зі штамами M. bovis в усіх дослідних зразках. Пасажування збудника через організм рисового довгоносика не спричинило зміну геному, які можна ідентифікувати методом VNTRгенотипування, тобто кількість тандемних повторів у варіабельних локусах залишилась без зміни. Порівнюючи морфологію та біологічні властивості мікобактерій вихідного штаму та культур отриманих після пасажування через організм жуків вирішили, що відмінністю є збільшення періоду появи первинного росту на живильному середовищі 1 зниження інтенсивності росту. Морфологія та тинкторіальні властивості залишались без змін. Досліджуючи біохімічні властивості дослідних культур встановили, що пасажування мікобактерій через рисового довгоносика сприяє збільшенню ферментативної активності. У дисоціативних форм (пасаж №118) відмічали підвищення активності дегідрогенази та нітратредуктази. У вірулентного штаму спостерігали більш стійкий геном, прояв біохімічної активності був слабким у вихідої культури, але після тривалого перебування збудника в організмі жука відмічали лише незначне підвищення активності нітратредуктази (через 12 діб після інфікування) та дегідрогенази (через 20 діб), що свідчить про активізацію механізмів захисту мікробної клітини та її адаптації до нових умов існування. Оцінюючи життєздатність виділених культур спостерігали тенденційне зниження кількості колонієутворюючих одиниць з кожною пересадкою жуків, у експерименті з дисоціативним штамом на 5,03% (культура виділена з суспензії з зерна на 4-ту добу досліду) – 97,53 % (на 30-ту добу) та на 73,85 % порівняно з вихідним штамом у культурах з гомогенізату жуків на 30-ту добу. У ІІ серії досліду (пасаж №100) – на 9,3% (на 4-ту добу) – 96,2% (на 20-ту добу) та на 62,8% у культурі з гомогенізату жуків на 30-ту добу. Встановили вплив рисового довгоносика на вірулентні властивості мікобактерій методом проведення біологічної проби в експерименті на мурчаках. При проведені біопроби культурами дисоціативних форм не спостерігали жодних клінічних ознак у дослідних тварин, протягом всього експерименту (90 діб) мурчаки набирали вагу. Після евтаназії проведено патологоанатомічний розтин, у внутрішніх органах та лімфатичних вузлах характерні зміни відсутні. У мазках-відбитках забарвлених за методом Ціля-Нільсена виявлено дослідні форми мікобактерій у всіх групах, посів суспензії на живильне середовище зумовлював ріст характерних колоній, що доводить персистенцію мікобактерій в організмі лабораторних тварин та виникнення доброякісного інфекційного процесу. Внутрішньом’язове інфікування мурчаків вірулентним штамом призводило до динамічного зниження маси тіла з 28-35-ї доби після інфікування, в місці інфікувння відмічали формування виразки на 20-ту добу після введення завису з наступним проривом (через 8-11 діб), проведення алергічної проби зумовлювало гіперемію шкіри та утворення виразки, загибель лабораторних тварин спостерігалась на 43,0±2,6-64,0±3,0 добу. При патологоанатомічному розтині відмічали характерні яскраво виражені зміни у внутрішніх органах та пахвинних лімфатичних вузлах. Найбільш патогенними виявились культури, що отримані з суспензії зерна на 12-ту добу експерименту, індекс ураження в тварин цієї групи зростав до 23,0±5,3 балів. При мікроскопії мазків-відбитків спостерігали дослідні мікобактерії в внутрішніх органах мурчаків всіх експериментальних груп. Після пасажування 100-го пасажу через жука збудник набув більшої патогенності через 12 діб перебування в організмі рисового довгоносика, загибель спостерігалась на 17,3% швидше порівняно з вихідним штамом, а індекс ураження зростав з 19,0±3,0 до 27,3±0,6 балів, однак при більш тривалому перебуванні збудника в організмі довгоносика мікобактерії поступово зменшували агресивність. При аліментарному інфікуванні мурчаків методом згодовування зерна на якому утримувались дослідні жуки протягом експерименту встановили, що лабораторні тварини набирали вагу до 49-56-ї доби, пізніше відмічалось зниження маси тіла. Загибель тварин спостерігали на 72-90-ту добу. Реакцію на введення ППД-туберкуліну відмічали лише на 60-ту та 90-ту добу. При розтині основною локалізацією патологоанатомічних змін була печінка, легені містили поодинокі осередки казеозних уражень. У кишечнику фіксували гіперемію судин. Шматочки уражених органів досліджували гістологічно. У легенях спостерігали виражений набряк, масивні зливні лімфоїдно-макрофагальні інфільтрати з наявністю периваскулярних лімфоїдних інфільтратів, відмічали ділянки підвищеної та зниженої повітряності. У селезінці спостерігали наявність масивних полів казеозного некрозу, серед тканин – багато гранульом з лімфоїдно-макрофагальною інфільтрацією та наявністю гігантські клітини типу Пирогова-Лангханса. Тканина лімфатичного вузла повністю некротизована, потовщено капсула інфільтрована лімфоцитами та макрофагами. Результати дисертаційної роботи можна використовувати в науководослідницькій роботі кафедр та в освітньому процесі для підготовки фахівців зі спеціальності 211 «Ветеринарна медицина», при виділенні мікобактерій туберкульозу в науково-дослідних установах і плануванні заходів діагностики, боротьби та профілактики туберкульозу в господарствах та в зерносховищах. The scientific work is devoted to the establishment of the epizootological role of rice weevil (Sitophilus oryzae (Linnaeus, 1763), Coleoptera, Curculionidae) as a potential reservoir of M. bovis in the process of emergence and spread of tuberculosis. The duration of accumulation inside the insect body and the release of dissociative and pathogenic forms of mycobacteria tuberculosis into the environment by the weevil was studied. The effect of passage through the organism of the weevil on the morphology and biological properties (culture, tinctorial, biochemical, virulence) of the pathogen was determined. The issue of tuberculosis has been relevant for many years due to the active spread of the infectious agent around the world, including in Ukraine. Currently, this issue has become more acute in Ukraine due to the hostilities, which cause increased migration of animals, both natural and artificial (evacuation), which poses a potential threat, worsens the epizootic situation and activates the spread of zoonoses, including tuberculosis infection. In the present study, the research was conducted using dissociative (117 and 118 passages) and virulent (passage №100) strains of M. bovis stored in the museum of the Department of Infectious Diseases of the State Academy of Environmental Health and the subcultures obtained from them. The optimal temperature of cultivation of the pathogen was determined upon obtaining the subculture. It was found that the studied strains have stable properties that are preserved when inoculated into fresh culture medium. The acceleration of the primary growth of subcultures of the 100th passage by 2.1 times, 117th passage by 1.1-1.3 times, and a decrease in the growth of subculture 118th passage by 2.0-2.3 times compared to the original cultures were noted. The viability of mycobacteria was determined in the obtained subcultures by counting colony-forming units and found that they were suitable for the next stages of the experiment. It was determined that the required concentration of mycobacterial suspension for infection of beetles is 1 mg per 1 cm3 of 0.9% isotonic sodium chloride solution for every 10 g of wheat grain, which ensures infection of 100% of beetles kept on the contaminated substrate. The ability of the rice weevil to mechanically transfer viable mycobacteria on the body surface was determined. By studying the period of carriage of the tuberculosis pathogen by the beetles, we proved the ability to store mycobacteria in the insect's body for a long time. In particular, in the first series of the experiment, when working with a dissociative strain for 50 days, the pathogen was detected in the homogenized beetle fluid and in the flushes from the surface of the weevil's body with a gradual decrease in the number of microbial cells in the microscope field of view. When sowing the homogenized homogenate of infected beetles on the nutrient medium, the growth of the experimental mycobacteria was observed only by day 30 after the start of the experiment, indicating a loss of viability of mycobacteria after a longer stay in the beetle's body. In the second series of the experiment, when rice weevil was infected with a virulent strain of mycobacteria, the pathogen was detected in smears and homogenized beetle fluid up to day 30 inclusive, and during microscopy of body surface washings - up to day 20. Similarly to the first series of the experiment, when the homogenized material was inoculated on the culture medium, growth was observed only in the tubes inoculated on the 30th day of the experiment. After studying the duration of mycobacterial isolation and contamination of environmental objects by rice weevils, it was found that during infection with dissociative forms of M. bovis, during microscopic examination, grain suspensions were detected by day 12 of the experiment (up to the third transplantation of beetles), and growth on the nutrient medium was recorded within 30 days after the start of the experiment (i.e., up to the fifth transplantation of beetles). In the experiment with the pathogenic strain, mycobacteria were detected in the homogenized beetle homogenate similarly up to day 12, and growth on the medium was detected up to day 20 after infection. In terms of morphology and culture properties, the pathogen isolated during the two series of the experiment was identical to the original culture. At each stage of the experiment, the isolated cultures were subjected to molecular genetic identification with confirmation of species affiliation. Genotyping of the cultures was performed using the VNTR method. It was proved that the length of amplicon fragments obtained as a result of PCR with primers targeting the VNTR locus was identical to the M. bovis strains in all the experimental samples. The passage of the pathogen through the rice weevil organism did not cause genome changes that can be identified by VNTR genotyping, i.e., the number of tandem repeats in the variable loci remained unchanged. Comparing the morphology and biological properties of mycobacteria of the original strain and cultures obtained after passage through the beetle organism, it was decided that the difference was an increase in the period of primary growth on the nutrient medium and a decrease in growth intensity. The morphology and tintorial properties remained unchanged. Investigating the biochemical properties of the experimental cultures, it was found that the passage of mycobacteria through the rice weevil increases enzymatic activity. In dissociative forms (passage №118), an increase in the activity of dehydrogenase and nitrate reductase was observed. A more stable genome was observed in the virulent strain, the manifestation of biochemical activity was weak in the initial culture, but after a long stay of the pathogen in the beetle's body, only a slight increase in the activity of nitrate reductase (12 days after infection) and dehydrogenase (20 days) was noted, indicating the activation of the defense mechanisms of the microbial cell and its adaptation to new conditions of existence. Evaluating the viability of the isolated cultures, we observed a tendency to decrease the number of colony-forming units with each transplantation of beetles, in the experiment with the dissociative strain by 5.03% (culture isolated from a suspension of grain on the 4th day of the experiment) - 97.53% (on the 30th day) and by 73.85% compared to the original strain in cultures from beetle homogenate on the 30th day. In the second series of the experiment (passage №100) - by 9.3% (on the 4th day) - 96.2% (on the 20th day) and by 62.8% in the culture from the beetle homogenizer on the 30th day. The effect of rice weevil on the virulence of mycobacteria was determined by conducting a biological test in an experiment on ants. During the bioassay with cultures of dissociative forms, no clinical signs were observed in the experimental animals, and during the entire experiment (90 days), the marmosets gained weight. After euthanasia, a pathological examination was performed, and there were no characteristic changes in the internal organs and lymph nodes. In the smears stained by the Ziehl-Nielsen method, experimental forms of mycobacteria were detected in all groups; sowing the suspension on the nutrient medium caused the growth of characteristic colonies, which proves the persistence of mycobacteria in the body of laboratory animals and the occurrence of a benign infectious process. Intramuscular infection of mice with a virulent strain led to a dynamic decrease in body weight from 28-35 days after infection, ulceration was observed at the site of infection on the 20th day after injection of the suspension with subsequent breakthrough (after 8-11 days), allergic test caused skin hyperemia and ulceration, death of laboratory animals was observed on 43.0±2.6- 64.0±3.0 days. At the pathological autopsy, characteristic pronounced changes in the internal organs and inguinal lymph nodes were noted. The most pathogenic were the cultures obtained from the grain suspension on the 12th day of the experiment, the lesion index in animals of this group increased to 23.0±5.3 points. Microscopy of smear-prints revealed experimental mycobacteria in the internal organs of the pigs of all experimental groups. After passage of the 100th passage through the beetle, the pathogen became more pathogenic after 12 days of stay in the body of the rice weevil, death was observed 17.3% faster compared to the original strain, and the lesion index increased from 19.0±3.0 to 27.3±0.6 points, but with a longer stay of the pathogen in the body of the weevil, mycobacteria gradually reduced their aggressiveness. In the case of alimentary infection of ants by feeding grain on which the experimental beetles were kept during the experiment, it was found that laboratory animals gained weight up to 49-56 days, later a decrease in body weight was noted. The death of animals was observed on the 72-90th day. The reaction to the administration of PPD-tuberculin was observed only on the 60th and 90th day. At necropsy, the main localization of pathological changes was the liver, the lungs contained single foci of caseous lesions. Vascular hyperemia was recorded in the intestine. Pieces of the affected organs were examined histologically. In the lungs, there was severe edema, massive confluent lymphoid-macrophage infiltrates with the presence of perivascular lymphoid infiltrates, areas of increased and decreased airiness were noted. In the spleen, there were massive fields of caseous necrosis, many granulomas with lymphoid-macrophage infiltration and the presence of giant PirogovLanghans cells among the tissues. The tissue of the lymph node is completely necrotized, the thickened capsule is infiltrated with lymphocytes and macrophages. The results of the dissertation can be used in the research work of the departments and in the educational process for the training of specialists in the specialty 211 "Veterinary Medicine", in the isolation of mycobacteria of tuberculosis in research institutions and planning measures for the diagnosis, control and prevention of tuberculosis in farms and granaries.